Cadernos de microbiologia/Compreensão pública da ciência

O Mais Belo Experimento da Biologia

Matthew Meselson (esquerda) e Franklin Stahl (direita) em 1996. Fonte: PNAS, Philip C. Hanawalt, 17889–17894, doi: 10.1073/pnas.0407539101

A década de 1950 foi um período movimentado para o DNA. Muitos trabalhos importantes foram publicados esclarecendo aspectos fundamentais sobre a natureza do material genético. A questão com a qual nos ocuparemos agora diz respeito a como o DNA é replicado. Não nos detalhes moleculares, mas na essência física. Após a publicação da edição de 1953 da revista Nature (baixe os artigos gratuitamente aqui) passamos a saber um pouco mais sobre a estrutura do DNA. Naqueles tempos três hipóteses concorriam para explicar essa essência da replicação: 1. a replicação do DNA seria conservativa, 2. a replicação seria semiconservativa e 3. a replicação seria dispersiva. Estes modelos foram originalmente propostos numa publicação de 1957 por Max Delbrück (1906-1981) e Stent Gunther (1924-2008)[1]. Delbrück foi laureado com o Nobel de fisiologia ou medicina em 1969, por desvendar como os vírus se replicam e, junto com Gunther, foi pioneiro nas pesquisas com os vírus bacteriófagos.

Os três modelos explicativos propostos por Delbrück e Gunther encontraram eco entre os pesquisadores da década de 1950, mas nenhum deles possuía suporte experimental suficiente. Segundo o modelo de replicação conservativa, o DNA faria uma réplica idêntica de si mesmo. Neste processo, as duas fitas originais permaneceriam inalteradas, enquanto duas novas fitas tomariam lugar. Como uma consequência inescapável desse modelo, após a replicação, algumas células ficariam sempre com as duas fitas originais. Segundo o modelo de replicação dispersiva, as fitas de DNA originais sofreriam quebras, enquanto novas fitas seriam sintetizadas e, depois, tudo isso se reorganizaria como dois pares. Ambos os modelos não ofereciam explicação sobre como os átomos seriam distribuídos entre as fitas novas e antigas.

Fonte : Moreira, C. (2010), WikiCiências, 1(9):0127

Ainda na edição de 1953 da revista Nature, James Watson (1928-) e Francis Crick (1916-2004) publicaram um artigo intitulado “Genetical Implications of the Structure of Deoxyribonucleic Acid”[2]. Naquela comunicação, fizeram um conjunto de previsões bastante acuradas sobre o comportamento do DNA, tendo como base os trabalhos que esclareciam sua estrutura. Uma das especulações que motivaram Matthew Meselson (1930-) e Franklin Stahl (1929-), a época sediados no Caltech, a empreender esforços para desvendar o modo como o DNA se replica foi a seguinte:

“We imagine that prior to duplication the hydrogen bonds are broken, and the two chains unwind and separate. Each chain then acts as a template for the formation on to itself of a new companion chain, so that eventually we shall have two pairs of chains, where we only had one before. Moreover, the sequence of the pairs of bases will have been duplicated exactly.” (Watson e Crick, Nature 171, 964-967, 1953)

Numa tradução livre, Watson e Crick adiantaram: “Imaginamos que, antes de duplicar, as pontes de hidrogênio são quebradas, e as duas cadeias desenroladas e separadas. Cada cadeia então age como um molde para a formação sobre si mesma de uma nova cadeia irmã, de modo que, eventualmente, devemos ter dois pares de cadeias onde antes tínhamos apenas uma. Além do mais, a sequência de pares de bases terá sido duplicada exatamente.”

Esta predição era favorável à hipótese de que o DNA se replicaria de maneira semiconservativa, isto é, conservando uma fita antiga e adicionando uma fita nova. Alguns pesquisadores importantes, entre eles Max Delbrück, eram bastante pessimistas com relação a esta hipótese por considerar que seria necessário uma grande quantidade de energia para separar as fitas unidas numa dupla hélice. Em correspondência com Watson e Crick, Delbrück acreditava que o processo de desenrolar e separar as fitas era hidrodinamicamente desfavorável. Como era comum na época, Delbrück era um físico fascinado por biologia.

Matthew Meselson operando uma Ultra-centrifuga analítica Spinco Model E, série 186. Fonte: Image Archive Caltech

Meselson, aluno de Linus Pauling, e Stahl resolveram investigar as três hipóteses e passaram mais de um ano desenvolvendo um método que fosse capaz de separar macromoléculas por ultra-centrifugação usando gradiente de densidade. A ideia consistia em obter amostras de DNA marcadas com um isótopo pesado de nitrogênio (N15) e centrifugá-las usando altas rotações em uma solução de cloreto de césio (CsCl).

N15-N14

Fotografia usando luz UV de uma mistura de DNA de bactérias marcadas com nitrogênio pesado ou leve. Fonte: Meselson M, Stahl FW. The Replication of DNA in Escherichia coli. PNAS, 1958

Era preciso uma forma de marcar o DNA e para isso, Meselson e Stahl mantiveram bactérias (Escherichia coli) em meio de cultura contendo o isótopo pesado N15 como única fonte de nitrogênio. Isso permitiria que as bactérias incorporassem o N15 do meio ao DNA, tendo assim cadeias mais pesadas, mais densas. Para diferenciar o DNA marcado do não marcado (i.e., o pesado do leve), as mostras foram misturadas e ultra-centrifugadas juntas.

O equipamento utilizado para separar e fotografar o DNA aparece na foto à esquerda sob o comando de Meselson. O resultado da fotografia usando luz Ultra Violeta (UV) pode ser visto na figura à direita. Como há DNA de bactérias crescidas em meio convencional (N14) misturado ao DNA daquelas crescidas em meio pesado (N15), a fotografia em UV mostra ambas as bandas. A imagem é lida da esquerda para a direita. Como você pode intuir, o DNA mais denso (N15) fica no fundo durante a centrifugação em gradiente de CsCl, enquanto o DNA menos denso (N14) aparece na banda mais alta. A conclusão deste teste foi que era possível diferenciar o DNA marcado do não marcado pelo perfil de bandas formado durante a centrifugação em gradiente.

Meselson

Fotografia em UV do perfil de separação de DNA marcado com isótopo pesado de nitrogênio. O intervalo de tempo entre cada aquisição é de 20 horas. Fonte: Meselson M, Stahl FW. The Replication of DNA in Escherichia coli. PNAS, 1958

Uma vez que Meselson e Stahl haviam conseguido marcar e diferenciar as mostras, podiam testar as hipóteses sobre a replicação do DNA. Após cultivadas em meio contendo N15, as bactérias foram transferidas para um meio de cultura contendo o isótopo leve N14, o que permitiria que as bactérias passassem a usar os átomos leves para sintetizar novas fitas de DNA. As culturas de E. coli com DNA pesado, agora crescendo em meio com nitrogênio leve, foram seguidas por diversas gerações e a cada 20 horas uma alíquota da cultura de bactérias era coletada para extrair DNA, centrifugar e fotografar usando UV. Os resultados obtidos vemos na figura à direita. A figura é lida de cima para baixo (gerações sucessivas) e da esquerda para a direita (quanto mais à esquerda, mais leve, quanto mais à direta, mais pesado).

A primeira fotografia (geração 0) mostra uma única banda, referente ao DNA marcado com o isótopo pesado. Observe que o registro a cada 20 horas foi capaz de revelar mais do que intervalos discretos entre gerações sucessivas. Olhando para a décima fotografia (geração 4.1) vemos uma banda mais intensa consistente com cadeias de DNA compostas pelo isótopo leve. No intervalo entre a geração zero e a geração 4.1, vemos a formação de uma banda intermediária entre o DNA leve e o pesado, esta banda intermediária é referente a uma mistura do isótopo leve com o pesado no DNA.

Vamos analisar as implicações destes resultados à luz das três hipóteses sobre a replicação do DNA. Olhando apenas para a banda intermediária descartamos a hipótese conservativa para explicar a replicação do DNA. A razão é simples, a hipótese conservativa exige que a dupla fita original (marcada com o isótopo pesado) seja conservada e usada como molde para gerar uma outra inteiramente nova. Esta hipótese não é consistente com o resultado da banda intermediária, já que esta banda se explica pela mistura dos isótopos. A observação da banda intermediária, no entanto, é consistente com os modelos de replicação dispersiva e semiconservativa.

A hipótese de replicação dispersiva considera que deve haver uma mistura das cadeias antigas com cadeias novas, dessa forma, deveríamos esperar a banda consistente com a mistura dos isótopos pesado e leve. O resultado que descarta a hipótese de replicação dispersiva é a última fotografia, uma mistura das amostras da geração zero com a geração 4.1, a qual mostra bandas de DNA completamente pesado (geração 0) e completamente leve (geração 4.1). A hipótese dispersiva assume que a banda intermediária deveria continuar presente já que a replicação se daria pela mistura de DNA antigo e novo, sempre usando o próprio DNA como substrato para sintetizar novas fitas misturadas.

Finalmente, os resultados são inteiramente consistentes com a hipótese da replicação semiconservativa do DNA. Uma forma rápida de visualizar isso é observar a penúltima fotografia, a qual é uma mistura de DNA das gerações zero e 1.9. Neste registro vemos nitidamente as três bandas que explicam o modelo no tempo, isto é, nas gerações sucessivas. A explicação é a seguinte: a dupla fita de DNA na geração zero está inteiramente marcada com o isótopo pesado (banda pesada). Quando as células iniciam o processo de divisão, a dupla fita precisa ser separada e cada cadeia serve como molde para a síntese de novas cadeias, o que explica a banda intermediária. Como cada fita age como molde e não como substrato (como no modelo dispersivo) a tendência é que nas próximas gerações o isótopo pesado seja inteiramente substituído pelo leve, já que as fitas novas são sempre sintetizadas usando os substratos disponíveis (aqueles fornecidos no meio de cultura).

Quando Meselson e Stahl publicaram seus resultados na prestigiada revista PNAS em 1958 não sabiam que, mais tarde, a artigo intitulado “The Replication of DNA in Escherichia coli[3] seria considerado o mais belo experimento de toda a biologia. A simplicidade e elegância deste experimento verdadeiramente mostram a genialidade dos pesquisadores. O experimento de marcação isotópica e ultra-centrifugação em gradiente de CsCl foi capaz de responder uma questão importante sobre o DNA. Contudo, a relativa simplicidade do experimento não é sinônimo de facilidade experimental. Meselson relatou que demoraram muito tempo para publicar este trabalho porque não sabiam exatamente como escrever os resultados e que recebeu orientações sobre como organizar os dados de professores como Richard Feynman (assista o relato do professor Meselson).

Para finalizar este texto, vale refletir sobre interdisciplinaridade. O caso é que os pesquisadores que deram origem ao campo que hoje chamamos biologia molecular eram fundamentalmente físicos ou químicos. É o caso de todos os nomes citados neste texto, com exceção de Watson, quem tinha graduação em zoologia. Após algumas décadas, perdemos completamente este insight de que é preciso conhecimento cruzado entre a física e biologia para que as coisas avancem. Hoje, muitos pesquisadores pensam em experimentos extremamente complicados para responder questões simples. Numa conversa de bar, um amigo físico certa vez mencionou que, do ponto de vista da física, as coisas no universo são simples, enquanto para a biologia tudo é complexidade. Ler os trabalhos clássicos nos faz aprender muitas lições sobre como é importante diferenciar complexidade de sofisticação.

Referências

  1. Delbrück M, Stent GS. (1957). On the mechanism of DNA replication. In McElroy, William D.; Glass, Bentley. A Symposium on the Chemical Basis of Heredity. Johns Hopkins Pr. pp. 699–736.
  2. Watson JD, Crick FH. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 1953;171: 964–7. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13063483.
  3. Meselson M, Stahl FW. The Replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 1958;44: 671–82. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=528642&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
  4. Vídeo instrutivo sobre o experimento de Meselson-Stahl

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